利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。在体外表达蛋白质，重要的是在努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构和生物学活性与天然蛋白一致。为此人们建立了大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和酵母四大外源基因表达体系以适应各种来源的蛋白质在体外高效表达。大肠杆菌系统具有产量高、成本低、生产周期短的特点，但胞内高水平表达的外源蛋白大多以不溶解、无活性的包涵体形式存在，而目前由包涵体中提取高水平、高比活的目标蛋白的最大问题是回收率极低，大部分目标蛋白在复性过程中析出丢失。杆状病毒系统采用先瞬时感染，然后裂解感染昆虫细胞的方式产生重组蛋白，此系统表达的蛋白折叠正确且被糖基化修饰，但有时糖基化序列与天然的不同，且蛋白产量不稳定。哺乳动物细胞表达系统生产的蛋白具有天然构象，稳定性好，糖基化模式没有发生改变，但哺乳动物细胞培养成本高，条件要求严格，蛋白表达水平较低。酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰等不足，因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。下面就酵母表达系统做一简单综述。

1.　酵母表达系统的特点
酵母，一般是指以芽殖为主，形态结构简单的一类真菌，主要分布于子囊菌亚门、担子菌亚门和半
知菌亚门。酵母作为一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物有时也有不足之处，如产物蛋白质可能出现不均一、
信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。解决内部降解的方法有三：一在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH 值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0 的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。另外，酵母表达系统还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

2.　几种常用酵母表达系统(宿主—载体系统)
（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD 的外源蛋白质，也不能使所
表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C 端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40 个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链仅含有末端1, 3 甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV 疫苗、口蹄疫疫苗等)。

（2）甲醇营养型酵母表达系统
甲醇营养型酵母包括汉逊酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)， 二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)等。 AOX1的甲醇诱导表达量可占胞内总蛋白质的20％-30％，表明AOX1 的合成受转录水平的调控。AOX1 启动子(PAox )具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用。
（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系统
裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物
具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。

3.　利用酵母表达外源基因的步骤
以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例，酵母表达外源基因包括如下步骤：将目的基因克隆入毕赤酵
母表达载体，收获阳性重组表达质粒，用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒，使之线性化，将线性化的阳性重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母菌株(如GS115，KM71)，将转化物接种HIS4 缺陷平板进行第一轮筛选，用不同浓度的G418 平板进行第二轮筛选，挑选10~20 个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量，挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因表达的蛋白质。

4.　在酵母表达载体中高效表达外源基因的策略
（1）增加整合在酵母染色体上的目的基因剂量
适当增加目的基因整合到酵母染色体上的拷贝数(即基因剂量)是有效提高外源基因表达量的基本策
略。但是，整合过多的外源基因拷贝数将可能导致重组DNA 的不稳定。
（2）控制外源基因中的AT 含量
研究发现外源基因的AT 含量直接影响其整合表达。Score 等在研究HIV-1 外壳蛋白的酵母表达时发
现，A 含量过高可以提前终止转录，得不到全长蛋白质产物，用人工合成具有较高 GC 含量的cDNA 进行表达，才得到了全长蛋白质表达产物，这与Macreadi 等的报道相似。
（3）选择最为合适的信号肽
酵母表达外源蛋白质可以是胞内的，也可以是分泌到胞外的，分泌到胞外对外源蛋白质本身而言更
稳定，产量也较胞内形式更高，因此人们多选择分泌型的表达菌株，但是信号肽具有选择性，所以选择合适的信号肽对于提高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的。Koganesawa 等在研究毕赤酵母表达系统的分泌信号肽时发现：使用OL 信号肽时，人溶解酵素的表达量明显高于家蚕溶解酵素的表达量。
（4）其他
外源基因在酵母菌表达的影响因素还有很多，如整合位点、mRNA 5’和3’非翻译区(UTR)、宿主
菌的Mut 表型、蛋白酶、表达蛋白质自身的特点、培养基及培养的环境条件等，有效控制各种影响表达的因素，对于外源基因的高效表达都是必不可少的。5.　甲

醇酵母表达系统的应用及前景
分子生物学技术的发展为利用生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已
发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种蛋白表达系统。最先使用的是酿酒酵母，1981年Hitzeman 等用酿酒酵母成功地表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性，缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定等。因此，人们在此基础上又寻找了新的酵母表达系统—毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母- 巴斯德毕赤酵母(Picchia Pastoris)具有高密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris 三种，其中Pichia Pastoris 作为基因表达系统使用得最为广泛。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。因此近年来关于此表达系统的研究得到迅速发展，在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白。

经过近十几年的不断发展，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内外相继展开了利
用该宿主菌株进行表达研究，并且有许多成功的报道。国家海洋局第三海洋所的陈丹等人在此酵母中表达了鲈鱼生长激素，表达量为100mg/L。美国Invitrogen 公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。在国内外实验室的共同努力下，利用巴斯德毕赤酵母基因表达系统必将生产出更多具有商业价值的外源蛋白。

(1) 在病原生物学领域中的应用
甲醇酵母表达系统经过20 多年的发展，已成为较完善的外源基因表达系统。应用该系统已高效分泌
表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白、蛋白酶抑制剂、膜蛋白等。在国内，甲醇营养型酵母表达系统主要应用在病原生物学领域，如：SMAD4 (肿瘤抑制基因)蛋白、痘苗病毒生长因子(VGF)、戊型肝炎病毒结构区ORF2 蛋白、旋毛虫肌幼虫Es 抗原特异性蛋白的2 个结构基因及恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1) 等的表达研究。

(2 ) 酵母表达体系在抗体工程中的应用
到目前为止，许多完整的抗体、抗体片段如Fab，单链抗体scFv 等均已在酵母中成功表达。在E.coli中以不溶性的包涵体形式聚集的蛋白质，在酵母中表达时常常是可溶的，而且异源蛋白的降解问题也可以部分得到解决。同时，在酵母表达系统中，分泌的重组抗体片段可以得到高水平表达。抗CD7 和抗DMI的2 种抗体，在E.coli 中的表达水平是0.25mg/L，但是在甲醇营养型酵母中的产量则分别为60mg/L 和10-25mg/L。同样，有功能的兔抗重组白血病抑制性ScFv 在甲醇营养型酵母中的产量比在E.col ：中高100 倍以上。目前，该酵母表达体系中已获得较高产量的完整抗体分子及抗体片段(表2)，而且它们具有与淋巴样细胞分泌的抗体相似的结合活性。抗体分子是糖蛋白，正确的糖基化为维持抗体的效应功能所必需。表达产物糖链中一般有8～14 个甘露糖残基，糖基化位点为Asn- X- Ser/Thr(其中X 可以是Pro 以外的任何氨基酸)，与哺乳动物的糖基化位点相同，且其末端一般不含有O- 1,3 甘露糖苷键(它对糖蛋白的抗原性起重要作用)。

在抗体工程中，酵母表达体系越来越受到重视。在大肠杆菌中不表达或表达水平很低，或者以包含
外源蛋白质产生量(g/L)

转化酶  2.3
D - 丙氨酸羧肽酶0.8
α- 淀粉酶2.5
Kuni tz 蛋白酶抑制剂(AbPP)0 1.0
瞬时抗凝蛋白(TAP) 1.7
破伤风毒素片段C 12.0
百日咳抗原P6 9 3.0
人免疫缺陷病毒1 膜外糖蛋白gp1 2 0 1.3
肿瘤坏死因子(TNF) 10.0
人转铁蛋白N 端4.0
表1：外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生
 

体形式聚集，亦或需要糖基化修饰的抗体或其片段，均可以考虑使用酵母表达体系，以高效表达有活性的抗体分子。
甲醇酵母表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等自身优势，使之越来越
受到关注，其研究和商业价值亦不断体现。在载体构建和新型菌株的开发方面，已经取得卓有成效的研究成果，例如Invitrogen 公司不断开发的新产品使此表达体系的前期研究愈加完善， 其开发出的快速筛选表达试剂盒(包括质粒pPICZ和pPICZa及其它必需材料)、多拷贝表达试剂盒(包括质粒pPIC3．5k，pPIC9k及 pAO815及其它必需材料)以及经典表达试剂盒(包括质粒pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2及 pHIL. S1及其它必需材料)大大方便了科研工作者的实验工作。 而对后期发酵过程和培养基配方等尚有待于进一步开展开创性的探索研究，突破传统培养发酵模式，优化培养基配方，为提高外源蛋白的表达量作出有益的探索。

Reference：
1. 宋丽雅，于群等，几种主要的酵母表达系统研究进展，中国输血杂志
2. 基因酷网站
3. 刘力颖等，基因工程抗体在巴斯德毕赤酵母中表达的研究进展，生物技术通讯