Protein At Beads 4FF 的重力柱说明书
货号：YA2470
规格：1*1mL / 1*5mL / 5*1mL / 3*1mL+1*5mL / 5*5mL
保存：2-8℃
产品说明：
    Protein At Beads 4FF 是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或 Fc-融合蛋白的亲和层析介质。Protein A 是
一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过 Fc 片段结合哺乳动物 IgG。Protein At Beads 4FF 的配体蛋白
Protein At 是在天然蛋白 A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白 A(Alkaline tolerate，故缩写为 At)。
Protein At Beads 4FF 是以高度交联的 4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗
体的纯化。

纯化流程： 1、Buffer 的准备
所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。
平衡/洗杂液：0.15 M NaCl、20 mM Na2HPO4，pH7.0
洗脱液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0
中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5 。
2、样品准备
    上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀
释，或者样品用平衡/洗杂液透析。
样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率 和防止堵塞柱子。
3、样品纯化
   Protein At Beads 4FF 重力柱使用请参考以下说明，各溶液用量均按照柱体积计算（柱体积是指填料体积）。

1) 水洗：将Protein At Beads 4FF 重力柱固定在铁架台上，依次去掉上端塞和下端塞，使液体流出。当柱内剩余
液面略高于上筛板，向管中加入 5-10 个柱体积的去离子水，去除残留的保护液。
2)平衡：当液面略高于上筛板，向柱管中加入 5 个柱体积的平衡液，进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓
冲体系下，起到保护蛋白的作用。
3)上样：将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少 2min，保证目的蛋白与介质充分接触，提高目的
蛋白的回收率。收集流出液，用于 SDS-PAGE 分析蛋白质的结合情况，在出现问题时，更方便寻找解决问题的方案。
4)洗杂：用 10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
5) 洗脱：使用 5-10 倍柱体积的洗脱液进行目的蛋白的洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可
以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗
脱组分体积 1/10 的中和液进行中和。
6)水洗：依次使用 3 倍柱体积的平衡液和 5 倍柱体积的去离子水平衡填料。将重力柱保存在等体积的 20%乙醇中，
置于 2-8°C 保存，防止填料被细菌污染。
4、SDS-PAGE 检测
   将纯化过程中收集的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效
果。
填料清洗
Protein At Beads 4FF 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和
结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗. CIP 清洗
Protein At Beads 4FF 是一种耐碱亲和介质，可以耐受 0.1M-0.5M NaOH 溶液的清洗，成本低，效果好，具体
操作：
1、3 倍柱体积的平衡液；
2、至少 2 倍柱体的 0.1–0.5 M NaOH，接触时间为 15 minutes；
3、5 倍柱体积的平衡液冲洗。
注：因 0.1–0.5 M NaOH 粘度大易造成压力增加，可进行反向冲洗。