详细说明

表达各种钠离子通道亚型的稳定细胞系信息如下   

  钠通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10% 胎牛血清及1.2mg/ml G418的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5%。

  细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1 ml TrypLE? Express溶液，37°C孵育1分钟。当细胞从皿底脱离，加入5 ml 37°C预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rmp离心5分钟收集细胞。扩增或维持培养，将细胞接种于10厘米细胞培养皿，每个细胞培养皿，接种细胞量为3.5*10⁵ cells（最终体积：10 ml）。

  为维持细胞的电生理活性，细胞密度必须不能超过80%。

  膜片钳检测，实验之前细胞用TrypLE™  Express分离，将3*10³ 细胞铺到盖玻片上，在24孔板中培养（最终体积：500μl），18个小时后，进实验检测。

电生理检测方法

     用微电极拉制仪（P97，Sutter Instruments）将毛细玻璃管（BF150-86-10，Sutter Instruments）拉制成记录电极。在倒置显微镜（IX71，Olympus）下操纵微电极操纵仪（MP285，Sutter Instruments）将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻。不给予漏电补偿。当全细胞记录的电流稳定后开始给药，每个药物浓度作用至5分钟后检测下一个浓度，在记录期间独立重复检测多个细胞。所有电生理实验均在室温下进行。实验数据由 EPC-10 放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster (HEKA)软件中。

检测实验的刺激方案：

数据质量标准

(1) 串联电阻 ≤ 20 MΩ；

(2) 封接电阻 ≥ 1 GΩ；

(3) 起始电流幅度适宜；

(4) 电流没有明显的自发性衰减(5分钟内自发性衰减小于5%)；

(5) 在膜电位为-80mV下无明显的漏电流 (漏电流 ≤ 100 pA)。

数据分析

首先将每一个药物浓度作用后的电流和空白对照电流标准化(),然后计算每一个药物浓度对应的抑制率(1-)。对每一个浓度计算平均数和标准误， 并用以下的方程计算每种化合物的半抑制浓度：

    用以上方程对剂量依赖效应进行非线性拟合， 其中c代表药物浓度，IC50为的半抑制浓度，h代表希尔系数。曲线拟合以及IC50的计算利用IGOR软件完成。

NaV1.1

NaV1.2

NaV1.3

NaV1.5

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